高效液相色谱基础知识详解！

高效液相色谱是现在食品实验室中应用非常广泛的一款仪器，有些朋友问液相色谱的问题，对它的原理知识不太了解。本期将简要科普下HPLC的基础知识。

（一）高效液相色谱法概述

高效液相色谱法(HPLC)是上个世纪七十年代迅速发展起来的一项高效、快速的分析分离技术，是现代分离测试的重要手段。色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(station phase)发生作用(吸附、分配、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。

HPLC是在经典的液相色谱法基础上发展起来的，其以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。其分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加精细，需高压泵推动，柱效高，分析速度快。与气相色谱不同的是液相色谱中流动相亦参与组分的分离过程，其组成、比例和pH值可灵活调节，分离模式多样。在实际操作中主要通过改变流动相的组成来调节样品在色谱柱的保留值和选择性，从而使不同样品得到分离。

高效液相色谱法自20世纪60年代问世以来，由于使用了高压输液泵、全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器，实现了对样品的高速、高效和高灵敏度的分离测定。高效液相色谱由于吸取了经典液相色谱的研制经验，并引入微处理机技术，极大的提高了仪器的自动化水平和分析精度。现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很高，既能控制仪器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等)，又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全的分析工具。

由于HPLC分析不受温度和样品沸点限制，因此具有更广阔的应用潜力。经过30多年的迅速发展，高效液相色谱法在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟，现已成为化学化工、环境、药学、食品等多个领域中最具优势的分离分析方法之一。

二）基本原理

液相色谱根据分离机理的不同可分为：

¬液固吸附色谱

¬液液分配色谱

¬离子交换色谱

¬离子对色谱法

¬分子排阻色谱(或凝胶渗透色谱)

（一）液-固吸附色谱

流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸附作用的不同来分离物质。

（二）液-液分配色谱

流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一种是涂于载体上的固定相。

流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相分配色谱法。

流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相分配色谱法。

（三）离子交换色谱

（四）离子对色谱法

（五）分子排阻色谱法

（三）结构构成

（1）泵的基本原理

（2）仪器：四元泵

（3）仪器：

手动进样器——六通阀/定量环

  手动样器——六通阀/定量仪器：自动进样器

（4）仪器：自动进样器

（5）色谱柱：柱温箱、色谱柱外挂架

（6）仪器：检测器——紫外

（7）仪器：化学工作站

（8）固定相与流动相

（9）流动相（反相

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